Sylabus
Seminář 1 – Polymerázová řetězová reakce a její modifikace (3 h) – Polymerázová řetězová reakce a její modifikace
Seminář 2 – Sekvenování (3 h) - studenti se teoreticky seznámí s principem sekvenace dle Sangera a NGS, budou seznámeni s jejich výhodami a nevýhodami a možnostmi využití v mikrobiologické diagnostice a výzkumu
Seminář 3 – MALDI-TOF a její aplikace v mikrobiologii (3 h) - studenti se teoreticky seznámí s principem a metodou MALDI-TOF, jejím využitím ve výzkumu a rutinní práci v mikrobiologii
Praktické cvičení 1 – PCR – praktické provedení izolace nukleové kyseliny a klasické PCR s detekcí produktu na gelu, vyhodnocení a porovnání výsledků standardní a real-time PCR (3-4 h)
Praktické cvičení 2 – MALDI TOF – praktické provedení identifikace kultur na přístroji (3 h)
Vyučující:
MUDr. Miroslav Fajfr, Ph.D.
Mgr. Radka Bolehovská, Ph.D.
Mgr. Rudolf Kukla, Ph.D.
Mgr. Radek Sleha, Ph.D.
Anotace
V mikrobiologické laboratoři se pro rutinní i výzkumnou práci již běžně používají molekulárně biologické metody. Jedná se zejména o polymerázovou řetězovou reakci (PCR) a její modifikace. Běžně se tedy používají PCR nebo nested, event. semi-nested PCR s následnou detekcí vzniklých produktů pomocí gelové elektroforézy, real-time PCR s využitím nespecifických interkalačních barev (SYBRGreen, EVAGreen atd.) nebo specifických sond (hydrolytické, hybridizační sondy a další). Své zastoupení mohou mít také rychlé metody jako LAMP. V předmětu se studenti s těmito metodami seznámí jak po teoretické, tak po praktické stránce. Bude probráno zařazení molekulárně biologických metod do jednotlivých oblastí mikrobiologické diagnostiky (virologie, bakteriologie, mykologie a parazitologie), kdy se rovněž zmíní výhody a nevýhody těchto metod. Studenti se seznámí se strategiemi a technikami izolace nukleových kyselin (DNA a RNA), problematikou reverzní transkripce, teoreticky se probere PCR, nested PCR a real-time PCR. V neposlední řadě se zaměříme také na metody sekvenování jako sekvenace podle Sangera nebo masivní paralelní sekvenování (MPS) neboli sekvenování nové generace (NGS), kdy budou zmíněny výhody a nevýhody obou metod. Dotkneme se i otázky studia mikrobiomu. Poslední částí předmětu bude hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF, která se v posledních 5-10 letech stala rovněž nedílnou součástí rutinní diagnostiky v bakteriologii a mykologii. V teoretickém úvodu budou studenti seznámeni s principy metody a jejím využití v identifikaci mikroorganizmů v mikrobiologii a v základech i možnosti této metody ve výzkumu v oblasti mikrobiologie.
V prvním praktickém cvičení si studenti vyzkouší izolaci nukleových kyselin a provedou PCR reakce s následnou detekcí produktů pomocí gelové elektroforézy. Ve druhém praktickém cvičení si poté studenti vyzkouší práci s MALDI-TOF při identifikaci různých bakterií.