Sylabus
Praktické cvičení zahrnuje práci v laboratoři (část A), interpretaci dat ze sekvenátoru a příprava datových matic (část B), vyhodnocování dat (část C) a základní praktikum analýzy next-generation sequencing (NGS) dat (část D).A: laboratorní práce - 2 dnyA1. sekvenování DNA - příprava a odladění PCR amplifikace požadovaného úseku DNA (nekódující úseky cpDNA, ITS…)- otestování úspěšnosti amplifikace elektroforézou na agarosovém gelu - přečištění PCR fragmentu pomocí kitu - kvantifikace PCR produktu (změření koncentrace na spektrofotometru) - vlastní sekvenační reakce (cycle sequencing) pomocí kitu ABI PRISM BigDye Terminator v3.1 - přečištění produktu, příprava pro analýzu na sekvenátoru - použití automatického sekvenátoru ABI 3130xl Avant na biologické sekci PřF UK A2. mikrosatelity- použití specifických primerů pro jaderné mikrosatelity (PCR reakce) - použití univerzálních pro chloroplastové mikrosatelity (PCR reakce) - otestování úspěšnosti amplifikace elektroforézou na agarosovém gelu - precipitace PCR produktů, příprava pro analýzu na sekvenátoru - fragmentační analýza na sekvenátoru ABI 3100xl Avant na biologické sekci PřF UKA3. základy přípravy NGS knihoven- fragmentace DNA pomocí Covaris M220
B: interpretace dat ze sekvenátoru - 1 denB1. sekvenování - editace sekvenčních dat (FinchTV aj.) ze sekvenátoru, příprava pro alignment - automatický alignment v programu ClustalX a MAFFT - úprava alignmentu, manipulace se sekvencemi – BioEdit, FaBox B3. mikrosatelity - jednoduchá analýza získaných dat v programu GeneMarker - vysvětlení problému se stutter bands, -A addition ad., příprava datové matice pro další analýzy C: analýza datových matic - 1 denC1. sekvenování - vyhledávání podobných sekvencí v GenBank (BLAST)- základní tvorby stromů (FastTree) - kodování indelů – SeqState - statistické parsimonické sítě - TCS- příprava datové matice pro další analýzy (NEXUS, PHYLIP formát ad.), konverze mezi formátyC2. mikrosatelity- základní analýza dat (MicroSatelliteAnalyser) - AMOVA (Arlequin)...D: základní analýza NGS data - 1 den- získávání FASTQ dat ze short read archive (fastq-dump) - analýza a hodnocení kvality (FastQC), trimming (Trimmomatic), odstranění duplikátů (fastuniq) - mapování readů na referenci (BWA) - analýzy namapovaných readů (samtools, Tablet) - de-novo assembly chloroplastového genomu (Velvet) - automatická anotace (web GeSeq)
Předmět je vyučován v rámci projektu CZ.02.2.69/0.0/0.0/18_056/0013322 s názvem ESF pro VŠ II na UK.
Anotace
Praktická výuka metod sekvenování DNA a mikrosatelitů s důrazem na jejich využití v systematice a populační biologii rostlin. Kurz je koncipován formou vědeckého projektu a zahrnuje přípravu projektu, práci v laboratoři, interpretaci dat ze sekvenátoru a přípravu datových matic, vyhodnocování dat a celkové vyhodnocení a prezentaci projektu. Kromě hodnocení klasických sekvenačních a mikrosatelitových dat je kurz věnován i základům analýzy next-generation sequencing (NGS) dat.
Předmět je vyučován v rámci projektu CZ.02.2.69/0.0/0.0/18_056/0013322 s názvem ESF pro VŠ II na UK.