Sylabus
Praktické cvičení zahrnuje práci v laboratoři (část A), interpretaci dat ze sekvenátoru a přípravu datových matic (část B), vyhodnocování dat (část C) a základní praktikum analýzy next-generation sequencing (NGS) dat (část D).
A: Laboratorní práce - 2 dny
A1. sekvenování DNA
- příprava a odladění PCR amplifikace požadovaného úseku DNA (nekódující úseky cpDNA, ITS…)
- otestování úspěšnosti amplifikace elektroforézou na agarosovém gelu
- přečištění PCR fragmentu pomocí kitu
- kvantifikace PCR produktu (změření koncentrace na spektrofotometru)
- vlastní sekvenační reakce (cycle sequencing) pomocí kitu ABI PRISM BigDye Terminator v3.1
- přečištění produktu, příprava pro analýzu na sekvenátoru
- použití automatického sekvenátoru ABI 3130xl Avant na biologické sekci PřF UK
A2. mikrosatelity
- použití specifických primerů pro jaderné mikrosatelity (PCR reakce)
- použití univerzálních pro chloroplastové mikrosatelity (PCR reakce)
- otestování úspěšnosti amplifikace elektroforézou na agarosovém gelu
- precipitace PCR produktů, příprava pro analýzu na sekvenátoru
- fragmentační analýza na sekvenátoru ABI 3100xl Avant na biologické sekci PřF UK
A3. příprava knihoven pro NGS
- sonikace DNA na přístroji Covaris M220, test na gelu
- příprava knihovny pomocí kitu NEBNext Ultra II
- kvantifikace knihovny na přístroji Qubit nebo LabChip
B: Interpretace dat ze sekvenátoru - 1 den
B1. sekvenování
- editace sekvenčních dat (FinchTV aj.) ze sekvenátoru, příprava pro alignment
- automatický alignment v programu ClustalX a MAFFT
- úprava alignmentu, manipulace se sekvencemi - BioEdit, FaBox
B3. mikrosatelity
- jednoduchá analýza získaných dat v programu GeneMarker
- vysvětlení problému se stutter bands, -A addition ad., příprava datové matice pro další analýzy
C: Analýza datových matic - 1 den
C1. sekvenování
- vyhledávání podobných sekvencí v GenBank (BLAST)
- základní tvorby stromů (FastTree)
- kodování indelů - SeqState
- statistické parsimonické sítě - TCS
- příprava datové matice pro další analýzy (NEXUS, PHYLIP formát ad.), konverze mezi formáty
C2. mikrosatelity
- základní analýza dat (MicroSatelliteAnalyser)
- AMOVA (Arlequin)...
D: základní analýza NGS data - 1 den
- získávání FASTQ dat ze short read archive (fastq-dump)
- analýza a hodnocení kvality (FastQC), trimming (Trimmomatic), odstranění duplikátů (fastuniq)
- mapování readů na referenci (BWA)
- analýzy namapovaných readů (samtools, Tablet)
- de-novo assembly chloroplastového genomu (Velvet)
- automatická anotace (web GeSeq)
Anotace
Praktická výuka metod sekvenování DNA a mikrosatelitů s důrazem na jejich využití v systematice a populační biologii rostlin. Kurz je koncipován formou vědeckého projektu a zahrnuje přípravu projektu, práci v laboratoři, interpretaci dat ze sekvenátoru a přípravu datových matic, vyhodnocování dat a celkové vyhodnocení a prezentaci projektu. Kromě hodnocení klasických sekvenačních a mikrosatelitových dat je kurz věnován i základům přípravy knihoven pro next-generation sequencing (NGS) a analýzy NGS dat.
Předmět je vyučován v rámci projektu CZ.02.2.69/0.0/0.0/18_056/0013322 s názvem ESF pro VŠ II na UK.