Praktikum z molekulární a buněčné biologie kvasinek

Sylabus

Seznam úloh:

• Využití různých variant světelné mikroskopie (fázový kontrast, Nomarského kontrast, fluorescenční mikroskopie) a barvících metod pro studium subcelulárních struktur kvasinkové buňky.

• Identifikace neznámého kvasinkového kmene pomocí klasických mikrobiologických metod umožňujících popsat základní vlastnosti kvasinkových kmenů (např. schopnost zkvašovat cukry, osmotolerance, křížení, sporulace, acidifikační test).

• Příprava geneticky modifikovaného kmene S. cerevisiae. Srovnání účinnosti genomové modifikace pomocí kazety pro homologní rekombinaci a transformace plazmidem. Příprava kmene exprimujícího GFP lokalizované do různých buněčných kompartmentů.

• Studium mnohobuněčných struktur tvořených kvasinkovými buňkami. Demonstrace přípravy a mikroskopické analýzy tenkých řezů z kvasinkových kolonií včetně pozorování rozdílné exprese fluorescenčně značených markerových genů ve fluorescenčním mikroskopu a fluorescenční lupě.

• Analýza rozdílné exprese markerových genů v buněčných populacích odebraných z deferenciované kvasinkové kolonie pomocí průtokové cytometrie.

• Stanovení rezistence k teplotnímu šoku u různých populací z diferenciované kolonie. Vyhodnocení pomocí průtokového cytometru.

• High-throughput screening celogenomové kolekce delečních mutant (tj, cca. 4600 kvasinkových kmenů) na osmorezistenci a respirační deficienci.

• Testování mutagenity chemických látek používaných např. v domácnostech pomocí geneticky modifikovaného kmene S. cerevisiae D7 (různé fenotypové projevy při aktivaci různých reparačních mechanizmů).

• Detekce Cu2+ iontů ve vodném roztoku pomocí buněk geneticky modifikovaného kvasinkového kmene imobilizovaných v alginátu.

• Analýza těkavých látek produkovaných kvasinkami různých rodů pomocí plynové chromatografie a hmotnostní spektrometrie GCxGC-MS  

Anotace

Šestidenní kurz po metodické stránce doplňuje přednášky Biologie kvasinek - MB140P24, Buněčné cykly a signály

- MB140P29 a Metody v molekulární a buněčné biologii- MB140S79.

Během kurzu se studenti obeznámí s moderními molekulárně biologickými a mikroskopickými metodami umožňujícími studium buněčné organizace a genovou manipulaci kvasinkových buněk stejně jako s klasickými mikrobiologickými metodami užívanými pro stanovení fyziologických charakteristik nebo taxonomického zařazení kvasinek. Seznámí se s rozmanitými kvasinkovými druhy z různých částí heterogenní skupiny kvasinek, zejména pak s druhem Saccharomyces cerevisiae jakožto s jedním z nejvýznamnějších modelových organismů současné experimentální biologie. Studenti v rámci praktika sami vytvoří geneticky modifikovaný kmen S. cerevisiae exprimující zelený fluorescenční protein (GFP) lokalizovaný do různých buněčných kompartmentů, pomocí nichž bude možné pozorovat jednotlivé buněčné organely za užití fluorescenčního mikroskopu. V rámci praktika se studenti také seznámí s průtokovým cytometrem a použijí ho pro vyhodnocení rozdílné exprese markerového genu v různých buněčných subpopulacích.

Část praktika je věnována diferencovaným mnohobuněčným útvarům, tj. kvasinkovým koloniím a biofilmům. Studenti si vyzkouší odběr jednotlivých subpopulací z diferenciované kolonie a následně otestují odolnost těchto subpopulací k teplotnímu šoku jakožto jeden z parametrů fyziologické rozdílnosti buněčných subpopulací. Počty senzitivních buněk budou stanoveny pomocí fluorescenčního barvení a následného vyhodnocení průtokovým cytometrem. Studenti dále otestují podmínky pro indukci pseudohyfálního růstu a vytvoří různé typy kvasinkových biofilmů. Bude demonstrována technika přípravy tenkých řezů z kvasinkových kolonií umožňující studovat lokalizaci jednotlivých subpopulací diferenciovaných buněk značených markerovými proteiny fúzovanými s GFP uvnitř kolonií pomocí fluorescenčního mikroskopu a fluorescenční lupy.

Poslední část kurzu se zaměřuje na možnosti aplikovaného využití kvasinkových kmenů. Studenti pomocí patentované metody detekují Cu2+ ionty v různých vzorcích pomocí imobilizovaného, speciálně geneticky modifikovaného kvasinkového kmene. Jiný kmen pak použijí pro testování mutagenity chemických látek běžně používaných v domácnostech.

Studenti pracují ve skupinách po dvou. Kurz je veden v českém jazyce. Jeden den z šestidenního kurzu probíhá v Biotechnologickém a biomedicínském centru Akademie věd a Univerzity Karlovy ve Vestci (BIOCEV).