Praktikum z molekulární genetiky

Sylabus

Úlohy řešené v průběhu praktik:

1.    Konstrukce bakteriálního expresního vektoru, produkce a purifikace GFP. Jedná se o jednu z nosných úloh praktika, v jejímž průběhu si studenti osvojí základní postupy molekulárně biologické praxe jako je PCR, restrikční štěpení, agarózová elektroforéza, izolace DNA z gelu, ligace, různé typy transformace transformace bakterií, neradioaktivní hybridizace pomocí digoxigeninem značené sondy, minipreparace bakteriální plasmidové DNA, produkce rekombinantních proteinů v bakteriálním expresním systému a sledování fluorescence zeleného fluorescenčního proteinu in vivo.

2.       Izolace plasmidové DNA a její sekvenace. Jedna z klasických metod molekulární biologie; účastníci praktika vyizolují pomocí tzv. alkalické metody bakteriální plasmidovou DNA, tuto přečistí a následně osekvenují metodou terminace řetězce (tzv. Sangerovo sekvenování). Výslednou sekvenci studenti anotují pomocí molekulárně biologických databází.

3.       Izolace proteinů pomocí afinitní chromatografie. V této úloze se studenti naučí produkovat cizorodé proteiny v bakteriálním expresním systému a tyto proteiny následně purifikovat, detekovat a ověřovat jejich funkčnost či aktivity. Součástí této úlohy příprava bakteriálních lyzátů, proteinová elektroforéza v SDS gelech, izolace proteinů pomocí afinitních chromatografií, imunodetekce izolovaných proteinů na pevném nosiči (tj. western blot) a ověření funkčnosti afinitně purifikovaných proteinů pomocí enzymatických přístupů.

4.       Práce s reportérovými geny u kvasinek; v průběhu této úlohy se posluchači naučí práci s kvasinkovými kulturami (transformace kvasinek, testování auxotrofií), včetně stanovení normalizované aktivity luciferázy a betagalaktosidázy v kvasinkových lyzátech pomocí luminiscenčních přístupů.

5.       Analýza nukleových kyselin; úloha zahrnující několik různých postupů využívaných při izolaci DNA a RNA z kvasinek (izolace chromozomální a plasmidové DNA) a rostlin (izolace celkové RNA včetně následné reverzní transkripce (RT-PCR)).

6.       Forenzní analýza DNA; izolace lidské DNA z bukálních výtěrů, určení krevních skupin a STR profilů účastníků praktika včetně následného statistické hodnocení.

7.    Fúzní PCR, účastníci tohoto praktického kurzu si vyzkouší jednu z komplikovanější strategií PCR, takzvané fúzní (slučovací) PCR s využitím dvou nezávislých templátových molekul.

8.    Stanovení exprese genů s využitím kvantitativního PCR (RQ-PCR); v této úloze budou studenti, pomocí absolutní kvantifikace, stanovovat počet kopií lidského genu naklonovaného v plazmidu, včetně následného statistického vyhodnocení.

9.    Teoretické úlohy; průběžně v průběhu praktika (bioinformatika, práce s databázemi, navrhování primerů, vyhledávání genů, výukové molekulárně biologické programy, dvouhybridní systémy, anotace neznámé sekvence in silico apod.).

Anotace

Pokud se nic zásadního nestane, praktikum z Molekulární genetiky (B140C39, 14 dní turnus) se v roce 2023/2024 bude konat od pondělí 26. 2. 2024 do pátku 8. 3. 2024.

Hlavním cílem tohoto kursu je seznámit studenty zejména 2. (či 3.) ročníku s metodami molekulární biologie s ohledem na možné využití těchto metod v laboratorní praxi studentů a se zřetelem na objasnění principů prováděných metod. V kursu se provádějí jak základní techniky molekulární biologie (např. izolace nukleových kyselin a proteinů), tak metody pokročilé (RT-PCR, RQ-PCR, STR analýza, klonování, produkce rekombinantních proteinů, luminiscenční techniky).