Sylabus
1. Teoretická část - přednáška:
Úvod do fluorescenční spektroskopie. Jablonského diagram, emisní spektra a jejich změny, doba života excitovaného stavu, fluorescenční sondy a informace o nich, zhášení fluorescence a jeho typy, FRET, polarizovaná fluorescence, časově rozlišená fluorescence, spektrofluorimetry. 2. Praktická část - úlohy: a) Kalibrace fluorometru, excitační a emisní spektra používaných sond, intenzita, spektra a polarita prostředí, vliv pH na spektra. Artefakty (vnitřní filtr, pozadí, korekce spekter, Ramanův rozptyl). Navržení optimálních podmínek pro pokus "v kyvetě" a pro pokus s konfokálním mikroskopu. b) Trp a Tyr jako přirozené fluorofory. Spektra Trp v proteinech, jejich změny při oligomerizaci a při zabudování do biologické membrány. c) Polarizovaná fluorescence. Anizotropie fluorescence, membránová fluidita, teplota a fázové přechody v syntetických lipidech a biologických membránách, fluidizace biologických membrán (artefakty: rozptyl a polarizace, korekce dat u složitějších biologických vzorků). d) Měření časově rozlišené fluorescence: stanovení koncentrace iontů Cl- (zhášení). e) Vyhodnocení dat z konfokálního mikroskopu: výpočet GP Laurdanu (fluidita buněčných mebrán); poměrové měření fluorescence a změny koncentrace vápníku v buňkách.
Používaný software: tabulkový procesor MS Excel nebo Gnumeric (GNU), Fityk (analýza spekter, histogramů, kinetik, nelineární regrese; http://fityk.nieto.pl/), WCIF ImageJ (analýza mikroskopického obrazu; http://fiji.sc/Fiji, http://imagej.net/Welcome).
Anotace
Praktikum fluorescenční spektroskopie s biologickými a biochemickými aplikacemi. Zahrnuje úvod do fluorescenčních metod, úvody k jednotlivým úlohám a jejich praktické provedení v oblastech: měření spekter, zhášení fluorescence, polarizovaná fluorescence, FRET, fluorescence proteinů, dynamika biologických membrán, měření fyziologických charakteristik živých buněk. Časově rozlišená fluorescence.
Analýza mikroskopického obrazu.