Sylabus
1. Stručný úvod do Genového inženýrství; historické milníky, modelové organismy využívané v GI, výhody/nevýhody jejich využití; porovnání klasických a netradičních genetických metod. Základní sled kroků pro umělý přenos genetické informace mezi buňkami pomocí metod GI a možnosti úniku z tohoto sledu.
2. Metody izolace nukleových kyselin z virů, organel a buněk; principy a přístupy s ohledem na vstupní materiál a následné využití nukleových kyselin. Přečistění nukleových kyselin. Izolace plazmidové DNA.
3. Principy separace NK; základy elektroforetických, centrifugačních a separačních technik, stanovení koncentrace a čistoty NK, principy separace proteinů. Chemická syntéza nukleových kyselin.
4. Syntéza NK; termolabilní polymerázy (posun přerušení, metoda náhodných primerů), Polymerázová řetězová reakce (historie, princip, fáze a průběh, složky PCR směsi, aditiva, problémy spojené s PCR).
5. PCR; varianty PCR (RACE, asymetrické PCR, in situ PCR, značení DNA pomocí PCR, multiplex PCR, mutagenní PCR, hot start PCR apod.), PCR s degenerovanými primery. Přepis RNA do cDNA (reverzní transkripce), různé varianty kvantitativního PCR (RQ-PCR), RACE-PCR. Metody fragmentace DNA - mechanická degradace (střižné napětí, ultrazvuk), enzymatická fragmentace DNA (sekvenčně nespecifická fragmentace nukleových kyselin)
6. Sekvenčně specifické degradace nukleových kyselin; restrikční endonukleázy (RE), restrikčně-modifikační systémy I-III, detailní popis RM systému II (klasifikace RE podle způsobu štěpení, rozeznávané palindromatické sekvence, typy konců generovaných RE a jejich využití při klonování, podmínky a problémy restrikčního štěpení, zastavení účinku RE, distribuce velikosti fragmentů).
7. Enzymy pro syntézu, modifikaci, spojování a úpravy konců DNA; aktivity, využití, výhody a nevýhody vybraných enzymů (např. Klenowův fragment DNA polymerázy I, T4 DNA polymeráza, Mung-Bean, Bal
31), kinázy, alkalické fosfatázy apod.). Využití polylinkerů a spacerů při klonování a úpravě nukleových kyselin. Radioaktivní a neradioaktivní značení nukleových kyselin, příprava sond, Southern blot, detekce.
8. Rekombinace fragmentů s vektorem in vitro; vektory rozdělení; vektory plasmidového typu; fagemidy, vektory odvozené od fága lambda (substituční, inserční), kosmidy, P1 vektory, PAC, BAC, YAC vektory. Ligázy, klonování kohezních a tupých konců.
9. Klonování genů; klonováni PCR fragmentů, klonování nezávislé na ligaci (LIC), GATEWAY systém, detekce rekombinantních klonů. Vnášení nukleových kyselin do organismů - transformace bakterií; transformace savčích a rostlinných buněk, stabilní a transientní transformace, Flp-In systém přípravy stabilních linií.
10. Mutageneze; chemické mutageny; vnášení mutací do NK pomocí enzymatických reakcí, oligonukleotidem řízena mutageneze, mutageneze pomocí PCR. Sekvenování DNA – metoda chemického štěpení, metoda terminace řetězce. Transkripce in vitro transkripce.
11. Exprese cizorodých proteinů; charakterizace expresních systémů; expresní systém odvozený od E. coli (výhody a nevýhody exprese v E. coli, expresní vektory se zaměřením na výběr vhodného promotoru, expresní kazety, možnosti izolace rekombinačních proteinů z buněk, optimalizace produkce obtížně se exprimujících proteinů). Translace in vitro. Významné laboratorní kmeny E. coli.
12. Genové inženýrství u eukaryot se zaměřením na kvasinku S. cerevisiae;stručný popis modelového systému S. cerevisiae (kmeny, využití podvojných vektorů, integrativní vektory, příprava knock-out kmenů, kvasinkové expresní systémy, cílená mutageneze in vitro). Expresní systémy založené na bakulovirových vektorech a tkáňových liniích, příprava genomových a cDNA knihoven.
13. Genové inženýrství vyšších eukaryot; analýza genové exprese (primer extension, northern blot, microarray, SAGE, Phage display, dvouhybridové systémy, footprinting, gel retardation assay); RNA interference, modifikace genomů (TALEN, Zinc-finger nucleases, CRISP/Cas9), genová terapie.
Anotace
V přednášce jsou popisovány jak základní tak i pokročilejší metody genově inženýrských přístupů a manipulací eukaryotických a prokaryotických organizmů. Přednáška je primárně zaměřena po popis principů a využití klasických genově inženýrských metod, jakožto nezbytného základu experimentální práce v laboratořích molekulárně biologického zaměření.
Mezi hlavní témata této přednášky patří izolace nukleových kyselin z odlišných typů buněk či tkání; chemická a biochemická syntéza nukleových kyselin včetně PCR a RT-PCR; degradace a modifikace DNA i RNA; využití restrikčních endonukleáz k přípravě rekombinantních molekul DNA; charakterizace a konstrukce rekombinantních vektorů; rekombinace DNA in vitro i in vivo; transformace různých typů buněk molekulami DNA i RNA; strategie selekce rekombinantních molekul, virů a buněk; místně specifické mutageneze a mutageneze in vivo; různé sekvenační postupy; konstrukce genomových a cDNA knihoven; strategie exprese cizorodých proteinů v různých expresních systémech; rozličné způsoby analýzy genové exprese; umlčování genů pomocí RNA interference; možnosti modifikace eukaryotických genomů in vivo a praktické využití genově inženýrských přístupů.
Metody a strategie jsou demonstrovány jak na in vitro systémech, tak i na systémech in vivo v bakteriích (E. coli) nižších eukaryotech (S. cerevisiae) a na tkáňových kulturách eukaryot vyšších.