Sylabus
Genomové manipulace a reverzní genetika Selekční a reportérové geny, nástroje pro manipulaci s genomem (místně specifické rekombinázy, místně specifické endonukleázy, homologní rekombinace) reverzní genetika - náhodná inaktivace genu (transpozonová mutageneze, TILLING, genová past), cílená inaktivace genu (knock-out, RNA-interference), regulovaná exprese genu. Genomové modifikace u modelových organizmů Charakteristika a specifika modelových organismů molekulární biologie (E. coli, S. cerevisie, D. melanogaster, C. elegans, A. thaliana, myš, člověk - tkáňové kultury), vytváření knock-outů, podmíněných knock-outů, knock-inů, metody transformace, vektory. Genové modifikace člověka - genová terapie In vivo a ex vivo genová terapie, kmenové buňky, klonování, indukované pluripotentní buňky, virové vektory pro genovou terapii (retrovirové, adenovirové, AAV), jejich produkce, nevirové vektory (transpozonové), metody transfekce, design polymerních nosičů DNA, přístupy genové terapie (exprese funkční alely genu, exprese sebevražedného genu, snížení exprese genu, oprava poškozeného genu), antisense terapie. Sekvenace DNA Chronologický pohled na sekvenační metody (metoda chemické degradace, dideoxy metoda, pyrosekvenování, metody druhé generace (454, Illumina, Ion Torrent),metody třetí generace (PacBio), sekvenace de novo vs. resekvenace, sekvenace exomu, postup sekvenace genomů, genomové projekty. Metody studia genové exprese Metody studia exprese jednotlivých genů: EST, Northern blot, qRT-PCR (kinetika PCR, hodnota Ct, sondy pro detekci, normalizace, efektivita PCR). Metody studia transkriptomu: DNA čipy (princip, prezentace výsledků: teplotní mapy, clusterování; dlaší oblasti použití DNA čipů), sekvenace RNA (RNA-Seq). Metody studia proteinů Stanovení koncentrace proteinů, separace: PAGE (denaturační, nativní), barvení, Izolace a purifikace proteinů s využitím afinitních tagů, imunoznačení-protilátky (primární, sekundární, způsoby detekce, výroba), imunoprecipitace, Western blot, ELISA, metody stanovení protein-proteinových interakcí na úrovni jednotlivých proteinů (pull-down assay, proximity ligation assay) i celého proteomu (koimunoprecipirace, TAP, 2-hybridový systém, komplementační assay, phage display), degron, protein arrays (analytický vs. funkční čip). Proteomika hmotnostní spektrometrie: separace, ionizační techniky, typy analyzátorů, tandemová MS. Fluorescence a fluorescenční značení Základy fluorescence, filtry a zdroje světla, fluorescenční značení buněk a organel, použití fluorescenčních sond, fluorescenční sondy pro měření vnitrobuněčného pH, koncentrace iontů, membránového potenciálu. Fluorescenční mikroskop, konfokální mikroskop a dvoufotonový konfokální mikroskop. Zelený fluorescenční protein (GFP) a jeho varianty. Možnosti využití fluorescenční proteinů, FRET, FRAP,FLIM.
Průtoková cytometrie.průtokový cytometr a buněčný sorter, princip měření, dot plot, gateování populací, mnohobarevná průtoková cytometrie, hmotnostní cytometrie. Pokročilé mikroskopické techniky Atomic force microscopy, mikroskopie blízkého pole, TIRM, fluorescenční mikroskopie s vysokým rozlišením (4Pi, STED, PALM/STORM). Metody budoucnosti Sekvenace DNA třetí generace (sekvenace nanopórem a další vyvíjené techniky), single-cell techniky (laserová mikropreparace, optická pinzeta, magnetická pinzeta), DNA origami a DNA nanoarray, lab-on-chip - mikrofluidní čipy.
Anotace
Pro akademický rok 2021/2022: přednášky budou probíhat prezenčně podle rozvrhu. Prezentace, odkazy na přednášky a další materiály budou k dispozici na Moodle https://dl2.cuni.cz/course/view.php?id=283 heslo pro vstup je: metodymb
Přednáška nabízí přehled širokého spektra laboratorních metod používaných v současné molekulární a buněčné biologii. Předpokládají se základní znalosti molekulární biologie, biologie buňky a genového inženýrství.