Cytometrie

Sylabus

Předmět Cytometrie je vyučován ve 4 cyklech, kdy v každém z nich je série 3 dvouhodinových přednášek (1,5 hodiny čistého času) vždy zakončená jedním praktickým 3-hodinovým cvičením (2 a 1/4 hodiny čistého času), a to ihned po poslední přednášce v dané sérii. 1. cyklus: Základy cytometrie

PŘEDNÁŠKY: 1. Základy cytometrické technologie - termíny a kus historieKlasifikace cytometrických technik - ruzné druhy detekce jednotlivých částic až po cytomiku (průtoková, hmotnostní, obrazová, -omics kombinace). Historie, parametry měřitelné pomocí průtokové cytometrie, základní části průtokového cytometru. Fluidika, laminární proudění, průtoková komůrka, hydrodynamická fokusace, principy sortingu.Elektronika a optika průtokových cytometrů - zdroje světla, rtuťové výbojky a lasery, optické filtry. Detekce světelných pulzů, fotodiody a fotonásobiče, parametry světelného pulzu. Zesilovače signálu, digitální zpracování signálů, kompenzace fluorescence, typy zobrazení výsledků analýzy.  2. Jednoduché aplikace průtokové cytometrieÚvod do analýzy dat - obsah jaderné DNA, stanovení ploidie, určení velikost jaderného genomu, identifikace mezidruhových hybridů, detekce aneuploidie, určení způsobu reprodukce, analýza kinetiky buněčného cyklu, apoptóza, endoreduplikace, analýza genové exprese, studium fytoplanktonu. 3. PRAKTICKÉ CVIČENÍ: Základy praktické analýzy datPředstavení open source SW pro základní způsob analýzy (FCSalyzer, příp. Flowing Software), komplexní SW balíky (SW: FlowJo, BC Kaluza, BD DiVa) a otevřená platforma R.What you see is what you get: datové standardy, kvalita dat, čištění dat, rozlišení a distribuce dat, škálování, transformace, základní způsoby zobrazování, jedno- a víceparametrická analýza DNA. 

Zápočtový test #1   2. cyklus: Základní cytometrické aplikace

PŘEDNÁŠKY: 4. Principy fluorochromů a praktické využití cytometrie v biotechnologiích a v biomedicíněZopakování předchozí praktické části s důrazem na standardizaci a reproducibilitu měření.Malé fluorochromy a fluorescenční proteiny, FRET (fluorescenční přenos energie) - tandemy a biosenzory.Selekční metody producentů v biotechnologiích, environmentální analýza, vazba na -omics metodiky. 5. Opakování, korelace měření a zobrazení datOpakování optiky: 3 osy v průtokové cele cytometru, laser delay, excitace a emise fluorochromů (emise fotonů a průchod optickými filtry a dichroickými zrcadly), prohlížeče spekter ("spectra viewer"), detektory (fotodiody, fotonásobiče, APD), zesilovače signálu.Analýza dat: parametry a detekce světelných pulzů, digitální zpracování signálu, nutnost kompenzace přesvitu fluorescence, typy zobrazení výsledků analýzy (1D, 2D, 3D, 4D-kinetika, multiD včetně vysvětlení redukce dimenzionality).Funkční testy v cytometriiApoptóza, proliferace, signalizace, membránový potenciál, kinetické testy, vzácné populace, metabolismus.Imunofenotypizace buněk a tkání: imunitní odpověď, nádory, infekce, mikrovesikly/mikropartikule. 6. PRAKTICKÉ CVIČENÍ: Návrh experimentuNávrh experimentu (který provedeme ve 3. praktické hodině) a limity cytometrické metodiky (statistika a pozadí - rare cell, autofluorescence, kompenzace, základy kombinací fluorochromů, návrh panelů protilátek) a teorie vlastní přípravy vzorku (pevné tkáně, bakterie, kvasinky, viry, "biosafety“ regulace)   3. cyklus: Detailní analýza a měření dat

PŘEDNÁŠKY: 7. Návod pro analýzu dat (titrace / voltrace)Ukázka analýzy vzorových titrovaných dat, měření titrovaných vzorků. 8. Práce s reálnými daty Kalkulace SI v FCSalyzeru, příprava reportu

Zápočtový test #2 9. PRAKTICKÉ CVIČENÍ: Příprava vzorku a měření multiparametrických datPříprava osmibarevného panelu monoklonálních protilátek dle doporučení EUROFLOW, značení a měření vzorku krve na 8-barevném cytometru BDFACSVerse (plus jednom dalším s více detektory = LSR-II, CytoFLEX S).   4. cyklus: Analýza multiparametrických dat 

PŘEDNÁŠKY: 10. Základní principy analýzy multiparametrických dat (FlowJo – úvod)Kompenzace dat, vizualizace, škálování, transformace, normalizace. Určení populací, FMO kontroly a kontroly obecně, konkatenace souborů, grafické a statistické výstupy ve FlowJo 11. Nácvik kompenzace dat (FlowJo) 12. PRAKTICKÉ CVIČENÍ: Práce s naměřenými datyPoužití komerčního SW (FlowJo) pro supervizovanou analýzu a R nástrojů pro nesupervizovanou analýzu naměřených dat, kontrola kvality naměřených dat, způsob jejich hodnocení, reportování, řešení problémů... příprava ke zkoušce

Zápočtový test #3

Anotace

Student bude provedený základní klasifikací cytometrických metod s jejich historickým kontextem. Technologické výhody a nevýhody jednotlivých vývojových směrů cytometrie budou dokumentované na aplikacích ve více oborech: imunologii, reprodukční biologii, botanice, mikrobiologii, protistologii, hydrobiologii, molekulární biologii, genetice a biomedicíně obecně.

Součástí je i práce s daty a praktická cvičení ve 4 tematických celcích (á 3 hodiny):

- analýza dat (základní)

- návrh experimentu

- příprava vzorku a měření multiparametrických dat

- reportování a analýza dat (pokročilá)

Aplikační využití cytometrie zahrnuje široké vědecké postupy a experimenty: analýzu a třídění různých velikostí částic od submikronových (chromozomů, bakterií, organel a vesiklů) přes buňky do velikosti stovek mikronů, ale i celých organismů až do velikosti 1mm. Analýza se neomezuje pouze na statické jednoparametrické "screeningové" experimenty, ale hlavní síla cytometrie je v multiparametrické analýze heterogenních vzorků a jejich funkčních vlastností. S objevem nových fluorochromů, včetně různých variant fluorescenčních proteinů, dnes můžeme studovat funkční projevy buněk až na úrovni protein-protein interakcí. Proto se stala cytometrie jedním ze stavebních bloků systémové biologie a umožňuje nám měřit desítky parametrů na miliónech buněk současně.

Technologie cytometrie i vlastní cytometrická data jsou velmi komplexní, plně standardizovaná a umožňují nám použití robustních statistických metod pro jejich analýzu. Součástí předmětu je proto praktická ukázka a detailní procvičení analýzy dat. Důraz je kladený hlavně na klasickou fluorescenční průtokovou cytometrii. Další varianty cytometrie, včetně hmotnostní a obrazové, budou probírané, ale nebudou předmětem vlastních praktických cvičení.

Absolventi budou mít po složení zápočtu a zkoušky:

- znalost principů jednotlivých směrů cytometrie

- znalost o funkci přístrojů a souvisejícím využití vhodných fluorochromů a prób

- znalost o stávajících aplikacích průtokové cytometrie v širokém spektru vědních oborů

- schopnost posoudit vhodnost zvolené metody při řešení konkrétního problému

- schopnost analyzovat a interpretovat výsledky získané průtokovou cytometrií

- schopnost kriticky hodnotit kvalitu cytometrických dat ve vědeckých publikacích