Sylabus
Fluorescenční mikroskopie v buněčné biologii
(syllabus přednášky; 2/0) 1. Základy mikroskopie - princip mikroskopu, zvětšení, limity zobrazení (Airyho disk, Rayleighovo kritérium). Práce s mikroskopem - Köhlerovo osvětlení a jak ho nastavit, olejová imerze, druhy objektivů, fázový kontrast, diferenciální interferenční kontrast. 2. Fluorescenční mikroskop. Luminiscence (fluorescence, fosforescence) - fyzikální podstata jevu, Jablonskiho diagram, příklady. Bioluminiscence. Fluorescenční spektrum (fluorofory v roztoku, quantum dots). Konstrukce fluorescenčního mikroskopu (zdroj světla - Hg výbojka, filtry, polopropustná zrcadla, detektor - CCD kamera), vlastnosti zobrazení, výhody oproti zobrazení ve světlém poli. 3. Konfokální mikroskop. Princip a konstrukce, historický exkurs, výhody a nevýhody oproti konvenčnímu mikroskopu. Skenovací mikroskop vs. spinning (Nipkow) disk. Speciální optické prvky: AOTF, AOBS, monochromátory, fotonásobič. 4. Snímání mikroskopického obrazu - obraz jako kompromis. Digitalizace obrazové informace. Šum detektoru (rozdíl mezi CCD kamerou a fotonásobičem, efekt chlazení detektoru), photobleaching, rychlost snímání, šíře spektra snímaného signálu…poměr signál/šum jako kritérium kvality obrazu. Úprava kontrastu. Spektrální separace fluorescenčních signálů, numerické metody jejího vylepšení. 5. Analýza mikroskopického obrazu. Kvantitativní měření intenzity fluorescence, morfologická měření, hodnocení vzájemné lokalizace dvou fluoroforů. 2D-scatterplot, kroskorelační funkce. 6. Biosensory, geneticky kódované fluorescenční značení proteinů. Mikroskopická měření koncentrací iontů, pH, membránového potenciálu. Tetracysteinové nekovalentní značky (FlAsH, ReAsH). GFP a další fluoreskující proteiny, speciální fluoreskující proteiny (GFP, timer, pHluorin). 7. Kinetická měření ve fluorescenčním mikroskopu. Snímání obrazu v čase, FRAP (FLIP, fotoaktivace, fotokonverze), FCS. Single particle tracking, mean square displacement. 8. Detekce inter- a intramolekulárních interakcí pomocí fluorescence. FRET, FLIM - podstata jevu, způsoby měření, aplikace. Spektrálně rozlišený obraz, multidimenzionální mikroskopie. 9. Restaurace obrazu - obrazová dekonvoluce. Mikroskopické zobrazení jako konvoluce, zobrazovací funkce mikroskopu (point spread function), principy inverzní transformace: přímá filtrace, iterační metody. PALM, korelativní mikroskopie. 10. Možnosti dalšího zvýšení prostorového rozlišení fluorescenčního mikroskopu. Nedokonalosti konfokálního zobrazení: limity rozlišení v laterálním a axiálním směru, absorpční hloubkový limit. Metody řešení: multifotonová mikroskopie, TIRF, SPIM, STED, strukturovaná iluminace. 11. Zpracování mikroskopického obrazu. Lineární filtrace, eliminace šumu, morfologická analýza, Fourierova transformace - hranové a pásmové filtry, princip automatického ostření mikroskopu. 12. Úprava mikroskopického obrazu pro vědeckou publikaci. Vhodné, nevhodné a neomluvitelné způsoby zpracování mikroskopického obrazu.
Anotace
Přednáška podává přehled fluorescenčně mikroskopických technik používaných v moderní buněčné biologii. Výklad vychází ze základních znalostí středoškolské fyziky a chemie a je zaměřen na praktické využití získaných znalostí.
Postupuje od objasnění základních principů mikroskopického zobrazení, přes nezbytné minimum technických detailů umožňující porozumění tvorbě mikroskopického obrazu, až ke konkrétním metodám vizualizace biomolekul a biochemických/fyziologických procesů v buňce. Důraz je kladen na možné zdroje artefaktů a možnosti jejich eliminace.
Předmět je určen studentům biologických oborů magisterského a doktorského studia.