Sylabus
- Příprava pufrů, vzorků, rehydratace IPG stripů, izoelektrická fokusace,
- Příprava SDS-akrylamidového gelu, jednorozměrná a dvojrozměrná elektroforéza, barvení bílkovin v gelu - Coomassie blue, stříbření a fluorescenční barvení.
- Digitalizace obrazu a obrazová analýza gelů a gelových sad.
- Výběr diferencálně exprimovaných bílkovin a jejich vypíchnutí z gelu, tryptické štěpení a extrakce peptidů.
- Analýza peptidové směsi metodami hmotnostní spektrometrie a identifikace výchozí bílkoviny. Peptidový fingerprint a sekvenční tagy (MS a MS/MS analýza).
Anotace
Proteomické praktikum MB170P112
Praktikum je rozděleno na dva bloky. V prvním, dvoudenním si účastníci projdou kompletním postupem přípravy vzorku pro necílený LC/MS experiment, použita bude SP3 metoda (1). Za účelem praktika připravíme směsné vzorky pocházející ze zajímavých myších modelů s přídavkem různých koncentrací cizorodého proteomu. V jednom experimentu tedy bude možné demonstrovat kvantifikačních schopností použité metody a její dynamický rozsah. Zároveň bude patrná změna na proteinové úrovni způsobená delecí části genu jež vede k zřetelnému fenotypu.
Vzorky budou převedeny do roztoku za přítomnosti detergentu a následně z nich enzymatickým štěpením trypsinem bude vytvořena směs peptidů připravená pro analýzu. Den vždy obsahuje teoretickou část, rozebírající jednotlivé kroky postupu a praktickou část kdy frekventanti praktika vzorky připraví. Závěrem tohoto bloku bude zahájení měření těchto vzorků na nano LC/MS Orbitrap Fusion hmotnostním spektrometru v kombinaci s kapalinovou chromatografií. Spolu s detailním seznámením se s metodou MS měření.
S časovým odstupem jednoho týdne naváže druhá čtyřdenní část zabývající se vyhodnocením naměřených dat. Použity budou volně dostupné softwarové nástroje MaxQuant (2) (https://www.maxquant.org/) pro identifikaci a kvantifikaci proteinů, Perseus (3) (https://maxquant.net/perseus/) pro statistické vyhodnocení a vizualizaci dat. Dále Vás seznámíme s programem Skyline (https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view) (4) určeným pro cílené kvantifikace peptidů. Všechny prezentované softwarové nástroje jsou pro akademické prostředí zdarma, mají grafické rozhraní a není nutné mít pro jejich použití programátorské zkušenosti. Použitý postup tedy můžete pak následně použít na vzorky se kterými se setkáte ve vaší laboratorní praxi
Závěrečné dva dny praktika pak budou zaměřeny na zpracování dat v prostředí R. Možnosti pokročilého vyhodnocení a vizualizace dat pomocí prostředí R za použití skriptů používanými pro vyhodnocování vzorků v naší laboratoři. A budou demonstrovány možnosti integrace dat pocházejících z různých OMICS metod – proteomics, transcriptomics and metabolomics 1. Hughes, C.S., Moggridge, S., Muller, T., Sorensen, P.H., Morin, G.B. and Krijgsveld, J. (2019) Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments. Nat Protoc, 14, 68-85. 2. Cox, J., Hein, M.Y., Luber, C.A., Paron, I., Nagaraj, N. and Mann, M. (2014) Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Mol Cell Proteomics, 13, 2513-2526. 3. Tyanova, S., Temu, T., Sinitcyn, P., Carlson, A., Hein, M.Y., Geiger, T., Mann, M. and Cox, J. (2016) The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nat Methods, 13, 731-740. 4. Schilling, B., Rardin, M.J., MacLean, B.X., Zawadzka, A.M., Frewen, B.E., Cusack, M.P., Sorensen, D.J., Bereman, M.S., Jing, E., Wu, C.C. et al. (2012) Platform-independent and label-free quantitation of proteomic data using MS1 extracted ion chromatograms in skyline: application to protein acetylation and phosphorylation. Mol Cell Proteomics, 11, 202-214.