6. Práce s DNA: Hledání pachatele trestného činu.
7. Ústní prezentace teorie a výsledků jedné úlohy.
1. Isolation of a protein - enzyme, determination of specific activity
2. Gel chromatography of proteins (separation, relative molecular mass determination)
3. SDS - polyacrylamide electrophoresis (determination of relative molecular mass of proteins)
4. Practical enzymology - kinetic characteristics, Michaelis constants, maximal reaction rate, pH optimum, activation and inhibition of enzymes, electrophoretic separation of isoenzymes and detection of the enzyme activity in gel
5. DNA manipulation (restriction analysis)
6. Oral presentation of one experiment
Studenti vypracují vždy jednu úlohu z následujících okruhů úloh: 1. Izolace proteinu s enzymovou aktivitou a stanovení specifické aktivity 2.
Gelová chromatografie 3. Separace proteinů elektroforézou v polyakrylamidovém gelu v prostředí SDS a stanovení relativní molekulové hmotnosti těchto proteinů 4.
Sledování afinity enzymu k substrátu - určení Michaelisovy konstanty a maximální rychlosti reakce 5 Určení pH optima, sledování vlivu inhibitorů a aktivátorů na aktivitu enzymu, časový průběh enzymové reakce, detekce enzymové aktivity v polyakrylamidovém gelu 6. Práce s DNA: Hledání pachatele trestného činu. 7. Ústní prezentace teorie a výsledků jedné úlohy.
Toto praktikum je určeno pro studenty II. ročníku bakalářského studia biochemie a chemie v přírodních vědách.
Praktikum zajišťují: Daniel Kavan, Veronika Hýsková, Josef Chmelík, Kateřina Bělonožníková a Jan Fiala
Studenti se seznámí se základními biochemickými metodami používanými při izolaci proteinů a nukleových kyselin. Provádí extrakci proteinů z přírodních materiálů, centrifugaci, vysolování, dialýzu, lyofilizaci... Další metodou, která má široké uplatnění v biochemii, je gelová chromatografie, studenti separují protein ze směsi nebo stanoví relativní molekulovou hmotnost neznámého proteinu. Separace proteinů a stanovení relativní molekulové hmotnosti se provádí rovněž elektroforézou v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti SDS. Velká pozornost je věnována zásadám práce s enzymy: stanovení specifické aktivity enzymu, zjištění afinity enzymu k substrátu, stanovení maximální rychlosti reakce, pH optima, sledování časového průběhu reakce a vliv inhibitorů a aktivátorů na enzymovou reakci. Přítomnost izoenzymů je demonstrována na příkladu laktátdehydrogenasy, kterou studenti separují v polyakrylamidovém gelu za nativních podmínek a detekují enzymovou aktivitu v gelu. Součástí praktika jsou ústní závěrečné prezentace a diskuse týkající se dosažených výsledků.
Všechny úlohy jsou koncipovány tak, aby je bylo možno experimentálně provést a vyhodnotit v časové dotaci 6 (vyučovacích) hodin. V případě potřeby je pedagogický dozor ochoten věnovat se studentům i nad rámec rozvrhované dotace. Pro klidné provedení všech úloh je dobré si pro praktikum vyhradit dostatek času. Všechny paralelky praktika budou začínat v 8:30.