kinetika vyhasínání; fluorescenční decay; průměrná doba života; kvantový výtěžek fluorescence;
zhášení fluorescence;
2) Detekce jednotlivých molekul: principiální rozdíly vůči klasickému měření fluorescence ze souboru
mnoha molekul; fotofyzika jednotlivých molekul; metody detekce fluorescence; konfokální versus
wide-filed mikroskop; metoda TIRF (total internal reflection fluorescence); detekce různých
proteinových konfigurací pomocí sm-FRET techniky; rotace a reorientace jednotlivých molekul;
3) Stopování jednotlivých molekul (Single particle tracking, SPT): difúze ve dvou rozměrech; náhodná
procházka; MSD diagramy; různé módy difúze: volná, ‚hindered‘ a hop-difúze. Metody měření SPT;
odvozené techniky: analýza svítivosti a TOCCSL (thining out clusters while conserving stochiometry
of labelling); kolokalizační analýza
4) Fluorescenční korelační kroskorelační spektroskopie (FCS a FCCS) I: teorie FCS: autokorelační a
kroskorelační funkce; translační difúze v FCS; inter-system crossing v FCS;
5) FCS a FCCS II: FCS ve dvou dimenzích: aplikace na membrány; FLCS technika; praktické aplikace
FCS: reakční kinetika, vázání proteinů na membránu, klastrování proteinů na membráně;
6) PCH – photon counting histogram: principy a aplikace v biofizice; shot noise; Number and brightness
metoda (N&B); fluorescence antibunching;
7) Depolarizace fluorescence: definice anisotropie; metody její detekce; excitační a emisní anisotropická
spektra; důvody depolarizace fluorescence; kinetika vyhasínání anisotropie; efekty rotační difúze na
fluorescenční anisotropii;
8) Försterův přenos energie (hetero-FRET): FRET v rámci jednoho donor-akceptorového páru; migrace
enegie mezi dvěma donory (homo-FRET); kinetika vyhasínání fluorescence a anisotropie; single
molecule FRET
9) Försterův přenos a migrace energie v poli mnoha donorů a akceptorů: kinetika vyhasínání
fluorescence v poli mnoha akceptorů, FRET na lipidové dvojvrstvě, určení šířky lipidové dvojvrstvy;
MC-FRET; detekce lipidových nanodomén; oligomerizace proteinů na membráně – kvantifikace
pomocí homo- a hetero-FRETu
10) Raster Image Correlation Spectroscopy (RICS) a Imaging-FCS: Principy a praktické aplikace
1) Introduction into fluorescence: Jablonski diagram; absorption and emission spectra; fluorescent
probes; kinetics of fluorescence deexcitation; fluorescence decay; average fluorescence lifetime;
quantum yield of fluorescence; fluorescence quenching;
2) Detection of individual molecules: principal differences between a classical fluorescence
measurements from a large ensemble of molecules and a single molecule fluorescence measurement;
photophysics of individual molecules; methods of fluorescence detection; confocal versus wide-filed
microscope; total internal reflection fluorescence (TIRF); detection of different protein configurations
by sm-FRET; rotations and reorientations of individual molecules;
3) Single particle tracking (SPT): diffusion in two dimensions; random walk; MSD diagrams; different
modes of diffusion: free, hindered and hop-diffusion. Methods of SPT measurement; Derived
Techniques: brightness analysis and TOCCSL (thinning out clusters while conserving stoichiometry
of labeling); colocalization analysis
4) Fluorescence correlation and cross-correlation spectroscopy (FCS and FCCS) I: theory of FCS:
autocorrelation and cross-correlation functions; translational diffusion in FCS; inter-system crossing
in FCS;
5) FCS and FCCS II: FCS in two dimensions: applications to lipid membranes; FLCS technique;
practical applications of FCS: reaction kinetics, protein binding to the membrane, clustering of
proteins on the membrane;
6) PCH - photon counting histogram: principles and applications in biophysics; shot noise; Number and
brightness method (N&B); fluorescence anti-bunching;
7) Fluorescence depolarization: definition of anisotropy; measurement of anisotropy; excitation and
emission anisotropic spectra; causes of fluorescence depolarization; kinetics of fluorescence
depolarization; rotational diffusion and its impact on fluorescent anisotropy;
8) Förster resonance energy transfer (hetero-FRET): FRET within one donor-acceptor pair; migration of
energy between two donors (homo-FRET); kinetics of fluorescence deexcitation and depolarization;
single molecule FRET
9) Förster resonance energy transfer and migration in the field of many donors and acceptors:
fluorescence deexcitation kinetics in the field of many acceptors, FRET on lipid bilayer,
determination of the thickness of a lipid bilayer; MC-FRET; detection of lipid nanodomains;
oligomerization of proteins on the membrane - quantification using homo- and hetero-FRET
10) Raster Image Correlation Spectroscopy (RICS) and Imaging-FCS: Principles and practical
applications
1) Úvod do fluorescence: Jablonskiho diagram; absorpční a emisní spektra; fluorescenční značky;kinetika vyhasínání; fluorescenční decay; průměrná doba života; kvantový výtěžek fluorescence;zhášení fluorescence;2) Detekce jednotlivých molekul: principiální rozdíly vůči klasickému měření fluorescence ze souborumnoha molekul; fotofyzika jednotlivých molekul; metody detekce fluorescence; konfokální versus wide-filed mikroskop; metoda TIRF (total internal reflection fluorescence); detekce různýchproteinových konfigurací pomocí sm-FRET techniky; rotace a reorientace jednotlivých molekul;3) Stopování jednotlivých molekul (Single particle tracking, SPT): difúze ve dvou rozměrech; náhodnáprocházka; MSD diagramy; různé módy difúze: volná, ‚hindered‘ a hop-difúze. Metody měření SPT;odvozené techniky: analýza svítivosti a TOCCSL (thining out clusters while conserving stochiometryof labelling); kolokalizační analýza4) Fluorescenční korelační kroskorelační spektroskopie (FCS a FCCS) I: teorie FCS: autokorelační akroskorelační funkce; translační difúze v FCS; inter-system crossing v FCS;5) FCS a FCCS II: FCS ve dvou dimenzích: aplikace na membrány; FLCS technika; praktické aplikaceFCS: reakční kinetika, vázání proteinů na membránu, klastrování proteinů na membráně;6) PCH – photon counting histogram: principy a aplikace v biofizice; shot noise; Number and brightnessmetoda (N&B); fluorescence antibunching;7) Depolarizace fluorescence: definice anisotropie; metody její detekce; excitační a emisní anisotropickáspektra; důvody depolarizace fluorescence; kinetika vyhasínání anisotropie; efekty rotační difúze nafluorescenční anisotropii;8) Försterův přenos energie (hetero-FRET): FRET v rámci jednoho donor-akceptorového páru; migraceenegie mezi dvěma donory (homo-FRET); kinetika vyhasínání fluorescence a anisotropie; singlemolecule FRET9) Försterův přenos a migrace energie v poli mnoha donorů a akceptorů: kinetika vyhasínánífluorescence v poli mnoha akceptorů, FRET na lipidové dvojvrstvě, určení šířky lipidové dvojvrstvy;MC-FRET; detekce lipidových nanodomén; oligomerizace proteinů na membráně – kvantifikacepomocí homo- a hetero-FRETu10) Raster Image Correlation Spectroscopy (RICS) a Imaging-FCS: Principy a praktické aplikace
Fluorescenční spektroskopie založená na detekci jednotlivých molekul (single molecule fluorescence spectroscopy) zažila v nedávné době nebývale rychlý rozvoj a stala se tak jednou z nepostradatelných metod v oblasti biofyziky. Cílem tohoto kurzu je teoreticky seznámit posluchače s tímto oborem. Důraz je kladen především na porozumění fyzikálně-chemických principů, na nichž jsou tyto metody založeny.
Užitečnost těchto fluorescenčních technik je demonstrována na mnoha praktických příkladech z oblasti biofyziky.