1. Regulace energetického metabolismu na úrovni celého organizmu I (K. Bardová) 23.2.

Energetická bilance organizmu. Metabolický obrat, glukózová homeostáza. Přímá kalorimetrie. Nepřímá kalorimetrie – RQ, energetický výdej, oxidace substrátů, cirkadiánní cykly.

2. Mitochondriální energetika a její tkáňová specifita, biogeneze OXPHOS (T. Mráček) 2.3.

Mitochondrie a jejich úloha v buňce. Specificita struktury a enzymového vybavení mitochondrií v různých tkáních – zajištění specifických fyziologických funkcí. Biogeneze enzymových komplexů, úloha pomocných proteinů (asemblační faktory). Organizace OXPHOS do vyšších celků – superkomplexy. Dynamika uspořádání OXPHOS, vliv struktury na regulaci energetického metabolismu.

Metody: nativní elektroforetické techniky

3. Regulace energetického metabolismu na úrovni celého organizmu II (P. Zouhar) 9.3.

Hnědá tuková tkáň – příklad specializace mitochondriálního metabolizmu. Lipidy a jejich metabolizmus, důležitost pro mitochondrie hnědého tuku. Obezita a metabolický syndrom

4. Regulační mechanizmy zabezpečující energetickou homeostázu buňky v zátěži (J. Žurmanová) 16.3.

Udržování energetické homeostázy buňky (ATP/ADP, CK, AK). Fosfagenové systémy v živočišné říši. Signalizace adenosinu. Glykolýza, β-oxidace a jejich regulace v srdci. Hexokináza a její role v regulaci apoptózy a MPTP. Hypoxické a ischemické podmínky (HIF regulace, Na přetížení, Ca přetížení). Laktátový metabolizmus - mozek - srdce – sval.

5. Regulace energetického metabolismu na úrovni celého organizmu III (O. Horáková) 23.3.

Hlavní metabolické dráhy energetického metabolismu. Coriho cyklus. Rendlův cyklus. Neurální a humorální řízení intenzity energetického metabolismu organismu. Regulace energetického metabolizmu během hladovění.

6. Životní cyklus mitochondrií (T. Mráček) 30.3.

Mitochondriální retikulum - statická struktura (tomografie) vs. dynamika. Proteiny zajišťující fůzi a dělení mitoretikula. Import proteinů do mitochondrií, degradace proteázami, mitochondriální UPR. Degradace celých mitochondrií - mitofagie.

Metody: mikroskopie, fluorescenční próby

7. mtDNA genetika, mitochondriální onemocnění (T. Mráček) 6.4.

Mitochondriální genetika – maternální dědičnost, heteroplazmie, segregace, bottleneck efekt. Mitochondriální transkripce a translace – regulace, koordinace s jadernou. Poruchy OXPHOS - kódované mtDNA, jaderně kódované, sekundární defekty OXPHOS

Metody: diagnostické metody, exomové sekvenování

8. Mitochondriální tvorba ROS (T. Mráček) 13.4.

Produkce ROS v OXPHOS a na jiných proteinech s mitochondriální lokalizací. Patologická vs. signální úloha ROS, regulace intenzity ROS produkce. Úloha ROS v procesu stárnutí organizmu.

Metody: fluorescenční metody, EPR detekce, biomarkery oxidativního poškození

9. Antioxidační ochrana buňky (J. Žurmanová) 20.4.

Cytosolická tvorba ROS. Antioxidanty odpovědné za přímé odbourávání ROS (SOD, CAT, PRX, GPX, GSTO), udržování redoxní homeostázy v buňkách (glutation, GSR, thioredoxiny, TXRD) a antioxidanty spojené s metabolizmem železa (HMOX), antioxidační a prooxidační účinky akonitázy (ACO1,2). Transkripční aktivita závislá na redoxním stavu buňky. Úloha oxidačního stresu v kardioprotekci.

10. Molekulární mechanismy biotransformace energie v mitochondriích (P. Pecina) 27.4.

Mitochondriální produkce ATP, chemiosmotická teorie. Enzymové komplexy mitochondriálního dýchacího řetězce, transport elektronů (redoxní centra). Strukturně/funkční interakce mezi jednotlivými komplexy dýchacího řetězce.

Metody: měření spotřeby kyslíku, měření mitochondriálního membránového potenciálu.

11. Mechanismy regulace OXPHOS (P. Pecina) 4.5.

Cytochrom c oxidáza jako model regulace oxidační fosforylace: Struktura a podjednotkové složení - srovnání prokaryotické a eukaryotické formy enzymu; Tkáňově specifické podjednotky: jaterní vs. srdeční isoformy podjednotek 6a, 7a a 8 savčí COX. Regulace parciálním tlakem kyslíku – HIF signalizace, COX 4 izoformy v regulaci afinity enzymu ke kyslíku. Postranslační regulace - tyrosinové fosforylace, Ser/Thr fosforylace řízené intramitochondriální cAMP/PKA drahou, acetylace.

Metody: metabolické značení, pulse-chase experimenty

Praktická část

návrh 2.5 dne v týdnu 9.-13.5. (nebo 20.-22.4.)

Analýza mitochondriálního metabolizmu. Studenti pracují se čtyřmi buněčnými liniemi, které představují kontrolní buňky nebo modelové defekty komplexů oxidačně-fosforylačního aparátu. Cílem je na konci této části odhadnout, jaké defekty jsou u jednotlivých linií přítomny.

Den 1: Teoretický úvod – analýza respiračního řetězce, použití substrátů a inhibitorů. Měření permeabilizovaných buněk na kyslíkové elektrodě (Oroboros Oxygraph 2k), hodnocení maximálních kapacit jednotlivých komplexů

Den 2: Analýza intaktní respirace a intenzity glykolýzy na přístroji Seahorse Bioanalyzer XFe. MitoStressTest a GlycolysisStressTest protokoly

Analýza celotělového metabolizmu. Nepřímá kalorimetrie a pozitronová emisní tomografie

Den 3: Teoretický úvod k principům metod. Hodnocení křivky získané z nepřímé kalorimetrie. Početní úlohy k aplikaci radiotracerů pro PET. (celkem 0.5 dne)