Optimalizace protokolu pro vyšetření genové exprese pomocí RTqPCR z tkáně zalité do parafinových bloků

Abstrakt

Tkáň fixovaná v parafínu (FFPE) je nejběžnější typ materiálu dostupného retrospektivně. Bohužel, pokusy o extrakci RNA z této tkáně často končí neúspěšně získáním malého množství degradované molekuly.

Naše studie se týká analýzy genové exprese z FFPE materiálu pomocí RTqPCR metody. Celý protokol se skládá z několika kroků: RNA extrakce, kontrola její kvality, reverzní transkripce a RTqPCR detekce.

V každém kroku jsme porovnali několik několik metod, vybrali nejlepší a sestavili předkládaný protokol. S ním jsme úspěšně analyzovali 95% vzorků (62/65).

Nejlepší se jevila tato kombinace metod: RNA extrakce komerčním kitem, opatrně interpretovaná spektrofotometrická kontrola kvality RNA, pečlivě zvolená reverzní transkriptáza a detekce genů pomocí TaqMan sond. Předkládaný protokol zvyšuje možnost využití FFPE materiálu pro metody molekulární biologie.

Klíčová slova

• formalin-fixed paraffin-embedded tissue
• gene expression
• real-time quantitative polymerase chain reaction
• reverse transcription
• TaqMan probe