Abstrakt
Cílem této studie bylo srovnání standardní laboratorní metody kultivace mezenchymálních multipotentních stromálních buněk (MSC) a nové techniky rychlé expanze MSC zaměřené na jednoduché klinické použití. Mononukleární buňky dárců kostní dřeně byly kultivovány po dobu 14 dnů standardním a novým kultivačním způsobem.
Standardní metoda (STD) byla založena na alfa MEM médiu doplněném fetálním telec ím sérem (FCS). Nová metoda bez živočišných bílkovin (CLI) byla založena na médiu klinického stupně CellgroTM, sdruženém lidském séru a lidských rekombinantních růstových faktorech (EGF, PDGF-BB, M-CSF, FGF-2) doplněných dexamethasonem, inzulínem a kyselinou askorbovou.
Buněčný produkt byl analyzován průtokovou cytometrií. Dále byly buněčné produkty metod STD a CLI diferencovány in vitro a byly provedeny histochemické a imunohistochemické analýzy, elektronová mikroskopie a elementární analýza.
Některé buňky byly naočkovány na biologicky rozložitelné lešení, in vivo implantovány imunodeficitním myším po dobu 6 týdnů a vyhodnoceny histologickými metodami. Výtěžky metody CLI po 14 dnech kultivace byly 40krát vyšší než výtěžky získané technikou STD (p <0,05).
Buněčné produkty metod STD a CLI splňovaly kritéria MSC, pokud jde o expresi antigenu hodnocenou průtokovou cytometrií, jakož i osteogenní, chondrogenní a adipogenní testy diferenciace in vitro. Navíc tyto buňky naočkované na trojrozměrných lešeních kultivovaných v osteogenním médiu produkovaly minerální depozity a fibrilární extracelulární matrici pozorované elektronovým mikroskopem.
Vklady zkoumané elementární analýzou obsahovaly vápník a fosfor v poměru 5: 3, což odpovídalo hydroxyapatitu. Buněčný produkt naočkovaný na biologicky rozložitelných lešeních a implantovaný do imunodeficitních myší byl schopen vytvořit kostní kalcifikovanou tkáň s krevním zásobením myšího původu.
V současné době používané metody kultivace mají ve srovnání s technikou CLI určité nevýhody, jako je delší kultivační doba, potřeba primárního rozšíření a opětného nasazení a použití FCS se všemi jeho možnými riziky. Vysoké výtěžky buněk získané metodou CLI za velmi krátkou dobu činí použití kultivovaných buněk potenciálně vhodných pro řízení akutního traumatu.
Jiné terapeutické neortopické aplikace buněk kultivovaných CLI musí být dále prozkoumány. Metoda CLI je jedinečná, rychlá, jednoduchá a postrádá přidání živočišných proteinů.
Buňky kultivované CLI splňují kritéria MSC. Metoda CLI potenciálně umožňuje kultivaci uzavřeného systému v podmínkách správné výrobní praxe (GMP).
Zdá se, že je snadno přenositelný do správné klinické praxe ve srovnání s jinými protokoly a měl by rozšířit možnosti buněčné terapie a tkáňového inženýrství chrupavky a kosti. Nová metoda je chráněna českým patentem 301 148 a evropským patentem EP 1999250 podle českého a mezinárodního práva.