Abstrakt
Východiska: Rezistence nádorových buněk k cytostatikům je způsobena řadou mechanizmů, které se často kombinují. Patří k nim redukovaný vstup cytostatika do buňky nebo jeho zvýšený eflux, zvýšená oprava DNA, defekty apoptotických drah, zvýšené odbourávání cytostatika a také zvýšená hladina intracelulárních thiolů glutathionu a metalothioneinů (MT).
Bylo popsáno, že vysoká koncentrace thiolových skupin v cytoplazmě váže platinové alkylační deriváty a chemorezistence je způsobena přenosem platiny z cytostatika na MT, které je inaktivují. Protože jsme v našich předchozích studiích prokázali zvýšení hladin MT v rezistentních neuroblastomových (NB) liniích, ale ne v senzitivních liniích po inkubaci s platinovými cytostatiky, zabývali jsme se významem MT-3 pro buňky NB.
Metoda: Buňky NB linie SiMa transfekované vektorem obsahujícím lidský MT-3 a GFP nebo pouze GFP (kontrola). Expresní microarray Human Cancer 3711 ElectraSense medium density 4 x 2k array slides s 1 609 DNA probami (Custom Array, Bothell, WA, USA), exprese MT-3 a nejvíce exprimovaných genů validována real-time polymerázová řetězová reakce (RT-PCR).
Citlivost k CDDP (cisplatina) - MTT test, vyšetření klonogenicity, průkaz štěpení kaspázy 3 Western blottem a volné kyslíkové radikály fluorescenční mikroskopií po barvení CellROX Deep Red Reagent. Hladiny mRNA MT-3 ve 23 vzorcích vysoce rizikových NB buňkách normální lidské kůry nadledviny a bovinní nadledviny byly vyšetřeny RT-PCR.
Výsledky: Expresní microarray prokázala downregulaci 3 a over-expresi 19 genů u MT-3 transfekovaných NB buněk. Pomocí genové ontologie bylo zjištěno, že over-exprimované geny řídí onkogeny indukovanou senescenci (CDKN2B a ANAPC5), a zvýšeně exprimované byly i geny glutathion S-transferázy M3, kaspázy 4 a DNAJB6 (chaperon neuronálních proteinů).
Prokázali jsme sníženou senzitivitu MT-3 transfekovaných buněk k CDDP (24 h IC50 7,48 +- 0,97 a 19,81 +- 1,2 µg/ml), vyšší počet kolonií po inkubaci s CDDP, snížené štěpení kaspázy 3 po inkubaci s CDDP a nižší volné kyslíkové radikály po jejich indukci CDDP. Buňky vysoce rizikových NB exprimovaly MT-3 významně více než nenádorové buňky nadledviny, ale nepodařilo se prokázat jednoznačný vztah k průběhu onemocnění.
Závěr: Prokázali jsme vztah mezi MT-3 a geny onkogeny indukované senescence a některými dalšími geny významnými pro osud buňky (glutathion S-transferáza M3, kaspáza 4 a DNAJB6) a významný podíl MT-3 na rezistenci k CDDP. Vysoké hladiny MT-3 u vysoce rizikového NB by mohly být jednou z příčin častých recidiv u tohoto nádoru.