Vliv kyseliny hyaluronové o nízké, střední a vysoké molekulární hmotnosti na lidské kmenové buňky zubní dřeně
Abstrakt
Úvod a cíl práce: Kmenové buňky zubní dřeně (KBZD) vykazují přirozeně vysokou pozitivitu na povrchový receptor glykoprotein CD44 podílející se mimo jiné na indukci mineralizace odontoblastů, přičemž kyselina hyaluronová (KH) je jeho hlavní ligandou. Cílem experimentu bylo posoudit vliv KH o nízké (NMH-KH), střední (SHM-KH) a vysoké (VMH-KH) molekulární hmotnosti na fenotypový profil, proliferačn í aktivitu a diferenciační potenciál lidských KBZD.
Metodika: Experiment byl proveden v in vitro podmínkách na dvou liniích lidských KBZD odlišných dárců (třetí molár - muž, 25 let, a první premolár - muž, 9 let). Tyto linie byly kultivovány ve standardním médiu a od druhé pasáže také ve třech experimentálních kultivačních médiích obsahujících 0,1 % kyseliny hyaluronové (KH) ve třech molekulárních hmotnostech: NMH-KH (116 kDa), SHM-KH (540 kDa) a VHM-KH (1500 kDa).
Analýza fenotypu byla provedena v sedmé pasáži pomocí průtokového cytometru Vi-Cell XR, viabilita byla měřena analyzátorem Vi-Cell v sedmé pasáži a počet buněk analyzátorem Z2 Coulter ve všech pasážích. Osteodiferenciace a chondrodiferenciace byly indukovány komerčně dodávanými diferenciačními médii a prokazovány histologickým barvením s alciánovou modří a alizarinovou červení.
Výsledky: Linie KBZD využité v našem experimentu vykazovaly fenotyp typický pro lidské KBZD (vysoká pozitivita pro CD 13, CD 29, CD 44, CD 90 a OCT3/4), byly schopny překročit Hayflickův limit a diferencovat v buňky produkující osteogenní a chondrogenní extracelulární matrix. Během experimentu dosáhly KBZD linie 1 kultivované v kontrolním médiu / médiu 1 (116 kDa KH) / médiu 2 (540 kDa KH) / médiu 3 (1500 kDa KH) v tomto pořadí celkem 14,1 / 15,3 / 15,4 / 14,8 populačních zdvojení.
Medián doubling time s minimální a maximální hodnotou ve stejném pořadí byl 31,6 (29,2; 36,8) / 29,6 (28,5; 30,6) / 30,3 (26,7; 31,3) / 30,5 (29,7; 33,8) hodin. Viabilita KBZD získaných ze sedmé pasáže byla ve stejném pořadí 92,3 / 93,1 / 91,8 / 92,6 %.
KBZD linie 2 kultivované v kontrolním médiu / médiu 1 (116 kDa KH) / médiu 2 (540 kDa KH) / médiu 3 (1500 kDa KH) dosáhly v tomto pořadí celkem 16,7 / 17,2 / 16,7 / 16,8 populačních zdvojení. Medi án doubling time s minimální a maximální hodnotou ve stejném pořadí byl 28,9 (24,5; 35,2) / 27,4 (24,5; 32,6) / 28,3 (24,0; 38,4) / 27,1 (25,3; 33,9) hodin.
Viabilita KBZD získaných ze sedmé pasáže byla ve stejném pořadí 80,1 / 82,5 / 81,8 / 80,9 %. Závěr: Ověřili jsme, že KBZD v přítomnosti kyseliny hyaluronové o molekulárních hmotnostech 116, 540 a 1500 kDa v koncentraci 0,1 % přežívají, proliferují a udržují si schopnost diferencovat ve zralé buněčné elementy.
Dále jsme ověřili původní předpoklad, že nízkomolekulární forma kyseliny hyaluronové bude mít rozdílný dopad na fenotyp KBZD než forma vysokomolekulární.