Abstrakt
Cíle: Cílem tohoto projektu bylo navázaní a rozšíření pilotního projektu, kde se ověřovala efektivita kryokonzervačního média při použití kombinace kys. hyaluronové (HA) o vysoké molekulární hmotnosti (1,5 MDa) a dimethyl sulfoxidu (DMSO) jako kryoprotektiva při kryokonzervaci kmenových buněk izolovaných ze zubní dřeně (KBZD) ve snaze dále snižovat množství toxického DMSO. Závěr: S experimentem jsme navázali na pilotní projekt s cílem pokračovat ve snižování koncentrace použitého DMSO jako kryoprotektiva při kombinaci s kys. hyaluronovou.
Oproti pilotnímu projektu jsme tento projekt rozšířili celkem o 6 podskupin rozdělených dle použitého kryokonzervačního média, kdy snižující se koncentrace DMSO byla 5,0%, 4,0% a 3,0%. Při kryokonzervaci dochází k úniku nitrocelulární vody vně z buněk a je důležité, jak rychle k poklesu teploty během kryokonzervace dochází.
Pro vytvoření rovnováhy mezi zevním a vnitřním prostředím buňky během poklesu teplot je ideální ovlivňovat tato prostředí kombinací vysokomolekulárního (LMW-KPA) a nízkomolekulárního kryoprotektiva (HMW-KPA). Je nutné nalézt optimální koncentraci obou komponent v kryokonzervačním médiu.
LMW-KPA pronikají do nitra buňky a chrání ji před dehydratací, díky snížení koncentrace elektrolytů. HMW-KPA zůstávají extracelulárně, kde stabilizují buněčnou membránu a snižují počet tvořených ledových krystalů.
V tomto experimentu jsme testovali koncentraci 5,0%, 4,0% a 3,0% DMSO s 0,1% a 0,2% kys. hyaluronovou. U všech podskupin rozdělených dle použitého kryokonzervačního média si buňky zachovaly viabilitu průměrně přes 90 % po 14 denní kultivaci po rozmrazení.
Zachovaly si tvar typický pro mezenchymové kmenové buňky a expresi povrchových znaků CD73, CD90 a CD146 jako na počátku experimentu. Byly vysoce proliferačně aktivní.
Navíc došlo k nárůstu exprese povrchového znaku CD49f. CD49f patří do skupiny integrinů, membránových receptorů, které se vážou na extracelulární matrix či na jiné buňky.
Umožňují tím přilnutí buněk k podkladu a také migraci buněk, což naznačuje jejich roli ve vývoji a hojení tkání. CD49f se exprimuje na mnoha typech kmenových buněk a může být považován za "stemness" znak, jelikož s jeho rostoucí expresí se zvyšuje také schopnost sebeobnovy, proliferace a diferenciační kapacita KBZD.
V pilotního projektu u KBZD kryokonzervovaných s 10% DMSO (negativní kontrola) v kryokonzervačním médiu jsme naměřili průměrnou viabilitu přes 93,8 % +- 1,0 % po týdenní kultivaci. Průměrná viabilita po týdenní kultivaci ze všech podskupin v tomto experimentu byla 93 % +- 0,6 %.
I při snížení koncentrace DMSO na 3 % byly viabilita KBZD srovnatelná s viabilitou KBZD kryokonzervovaných standardním protokolem s použitím 10% DMSO. Průměrná viabilita ihned po rozmražení byla dokonce vyšší ne ž v případě využití 10 % DMSO (72,3 % +- 4,2 % vs. 65,0 % +- 1,4 %).