Ověření nálezu změn metylace z analýzy MS-MLPA metodou přímé Sangerovy sekvenace po bisulfitové konverzi – optimalizace pro diagnostiku

Abstract

Úvod : Na našem pracovišti jsme vyšetřovali rodinu, u níž někteří členové mají mírné projevy BWS. Proband (III/3) má makroglosii, vyšší porodní hmotnost a névus na obličeji, mírnou makroglosii a névus má i bratr probanda (III/1). Matka probanda (II/1) měla zvětšený jazyk v dětství, ale sestra probanda (III/2) nemá žádné známky nadměrného růstu tkáně, . V rodině jsme pomocí metody MS-MLPA objevili dosud nepopsanou deleci v oblasti IC2 (KCNQ1OT1:TSS-DMR, KvDMR) na chromosomu 11p15.5. Navzdory shodnému rozsahu delece u všech jejích nosičů, jedna metylačně-specifická sonda v těsně přilehlé oblasti ukazovala u jednotlivých členů rodiny rozdílný metylační profil. Jelikož signál této MS-MLPA sondy je založen na metylaci pouze dvou CpG párů, rozhodli jsme se nález ověřit.

Cíl : Cílem našeho výzkumu bylo zavést a optimalizovat v klinické laboratoři metodu, pomocí které bude možné ověřit metylační profil z MS-MLPA a která bude rychle proveditelná, cenově dostupná a poskytne nám informace o metylačním profilu v blízkosti delece u naší rodiny.

Materiál a metody : Pro výzkum jsme použili vzorky DNA izolované z periferní krve negativních (n=5) a pozitivních (n=3) kontrol a vzorků jednotlivých členů rodiny s delecí v IC2. Se všemi vzorky bylo nakládáno v souladu s informovaným souhlasem s využitím materiálu k výzkumným účelům. Všechny analýzy jsme provedli v duplikátu. DNA pacientů i kontrol jsme modifikovali pomocí bisulfitové konverze (EpiJET Bisulfite Conversion Kit od thermoscientific(R)) a následně jsme provedli přímou sekvenaci dle Sangera.

Výsledky

Porovnání výsledků pozitivních a negativních kontrol přineslo jasné rozdíly v detekované úrovni metylace. U naší rodiny s delecí v IC2 jsme pomocí této metody potvrdili výsledky z analýzy MS-MLPA a u jednoho člena tato metoda odhalila dříve nezachycený metylační profil v nízkofrekvenční mozaice. Přímá sekvenace DNA po bisulfitové konverzi se tedy ukázala jako efektivní a cenově dostupný nástroj, který je po optimalizaci možné použít pro kvantitativní vyhodnocení metylačního profilu v klinicky významných oblastech.

Závěr : Zjistili jsme, že přímá sekvenace DNA po bisulfitové konverzi odpovídá výsledkům z MS-MLPA a po jisté optimalizaci představuje relativně rychlý a efektivní přístup pro detekci metylace, který je aplikovatelný v běžné klinické laboratoři a který by zdaleka neměl být zapomenut. Dokonce vznáší otázku, zda je dosud používaná diagnostická metoda MS-MLPA dostatečně citlivým nástrojem k detekci metylace. U naší rodiny jsme sekvenací DNA po bisulfitové konverzi úspěšně objasnili metylační profil v blízkosti delece a dále pracujeme na otázce, jak tento profil vznikl a jaký má vliv na penetranci Beckwith-Wiedemannova syndromu v rodině.